一. 产品简介

过氧化氢(H2O2)超快检测试剂盒利用H2O2与显色底物之间的反应，生成红色氧化产物，通过比色法或荧光法检测样品中的H2O2，反应在10  s内即可完成，检测限为0.02 μM，可实现H2O2的超快灵敏检测。

二. 试剂盒组成与存储

本试剂盒采用4 ⁰C运输，收货后请储存在-20 ⁰C。

三. 实验步骤

1. 溶液配制

Ø 增敏剂溶液：将1 mg增敏剂溶解在1 mL缓冲液中，得到增敏剂溶液。

(注：增敏剂溶解后请按每管50 μL或100 μL分装保存至-20℃，避免反复冻融)

Ø 50 μM H2O2标准液：取10 μL H2O2母液(10 mM)，加入至1.99 mL缓冲液并混匀，该标准液可在4 ℃长期储存。

Ø 检测液(以配制1 mL为例)：取1 mL缓冲液，加入10 μL 显色液和50 μL 增敏剂溶液。(注：1  mL检测液可检测20次，但标准曲线绘制需消耗6次，请合理计算检测液配制量。检测液配制后，可在4℃避光保存24h，使用时避免强光照射)。

2. 分别取0、2.5、5、10、20、40 μL的50 μM H2O2标准液加入至96孔板中，并加入缓冲液补足至50  μL，得到浓度依次为0、2.5、5、10、20、40 μM的H2O2溶液。取50 μL待测样品溶液，加入至另外的空白孔中。

3. 向每个孔分别加入50 μL检测液，避光反应至少10s，通过酶标仪测定570  nm处吸光度，建立标准曲线，根据标准曲线计算样品溶液中H2O2浓度。

图1. 比色法建立的H2O2标准曲线

(受仪器和操作影响，本曲线仅供参考)

四. 注意事项

Ø 显色液对光敏感，请注意避光保存和使用，使用过程中避免长时间强光照射;

Ø 检测液须现配现用，若略微变红，仍可正常使用;若颜色明显变红，建议重配;

Ø  若检测过程中发现检测溶液先快速变红，后又褪色，说明待测样品溶液中H2O2浓度过高，使得显色底物氧化漂白。当待测样品溶液中H2O2浓度已经超过检测范围时，应将样品溶液稀释后再进行测定。

Ø 若检测溶液中存在H2O2之外的其他强氧化物质时，可能会导致假阳性。因此，建议增加不含H2O2的样品溶液作为对照。

Ø  向样品溶液中加入检测液10s内，溶液发生明显的显色反应，10s后即可检测出样品中的H2O2。随时间延长，显色底物会被水中的溶解氧缓慢氧化，长时间放置(约12小时)，溶液颜色也会缓慢加深。因此，向样品溶液中加入检测液后应及时检测。

Ø 当样品溶液中H2O2浓度极低时，本试剂盒还可以通过荧光法检测H2O2，***低可检测0.02 μM的H2O2。具体步骤如下：

1)取5 μL的50 μM H2O2标准液，加入495 μL缓冲液，配制成0.5 μM H2O2标准液。

2)分别取0、2.5、5、10、20、40 μL的0.5 μM H2O2标准液加入至96孔板中，并加入缓冲液补足至50  μL，配制浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μM的H2O2标准溶液。取50 μL待测样品溶液，加入至另外的空白孔中。

3)向每个孔分别加入50 μL检测液，避光反应至少10s，采用酶标仪测定激发波长为540 nm，发射波长为590  nm处的荧光值，建立标准曲线，根据标准曲线计算样品溶液中H2O2浓度。

图2. 荧光法建立的H2O2标准曲线 (供参考)