本文主要从以下四个方面，1. 色谱柱柱压 2. 色谱峰峰形 3 . 色谱峰保留值 4 . 色谱柱柱寿命概述如何排除故障。

一、色谱柱柱压

1、柱压高多少正常?

同一条件：新色谱柱，C18，5µm，球形，4.6×250mm，100%甲醇，1mL/min，25℃，管路内径0.3mm(0.010″)，通常:<7MPa。

如果柱压高了，先确认出压力升高的组件，有可能是色谱柱也可能是其他组件的原因。色谱柱污染、填料堵塞、筛板堵塞都会造成压力升高。

2、确定压力升高来源?

保护柱-卸下保护柱，仪器堵塞-卸下色谱柱，色谱柱进口端堵塞-反方向测试(不是反冲!!)如果是色谱柱引起的柱压升高，问题是……

3、冲洗色谱柱

反相色谱柱(C18,C8)

按照以下方式冲洗：

a、 水/乙腈95/5→0/100

b、

如果不行，可在异丙醇里加1%TFA.

使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱，在重新使用反相流动相以前，必须用异丙醇过渡!正相色谱柱(SiO2.Diol)，以下溶剂至少各50ml冲洗色谱柱:

原则：使用比MP更强的溶剂冲洗二氯甲烷>丙醇>四氢呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水。那么冲洗色谱柱 一定正确吗?

C18柱上蛋白的冲洗： 是DMSO而不是THF!!

C18柱上淀粉的冲洗： 是水而不是甲醇!!

根据强保留污染物性质，选择合适的冲洗溶剂和程序!!

4、冲洗筛板

强溶剂、反方向、低流速。

反相色谱柱：水/乙腈95/5→0/100

正相色谱柱：

50%甲醇+50%三氯甲烷→ 100%乙酸乙酯

-冲洗筛板不要连接检测器

-不建议用户自行更换筛板

5、预防柱压过高

a、使用保护柱

b、样品前处理(重点讨论样品类型)

c、经常冲洗色谱柱

d、过滤流动相

e、缓冲液或水不要保存过长时间

6、样品基质如何去除 ?

制剂：淀粉、硅胶、其他添加剂

中药：强疏水性成分

二、色谱峰峰形

常见以下几种情况：色谱峰拖尾、色谱峰分裂、色谱峰扩展，许多色谱峰峰形问题都是复合型问题， 造成色谱峰扩展和柱效降低;色谱峰扩展和拖尾或拖尾随保留加剧。从以下几个方面色谱柱问题、溶剂效应、进样量(过载)、样品的特性、柱外效应来分析。

1、色谱柱问题

污物在柱进口处积聚-强溶剂冲洗柱子

二次保留效应-加入扫尾剂,10mM的TEA

重金属污染-使用高纯硅胶基质色谱柱

对于难溶解的物质：小体积强溶剂溶解以后用MP稀释，扫尾剂：30mM的TEA(B性化合物)，醋酸胺(A性化合物)

二次效应

不加TEA 10mM的TEA

ASB C18,4.6×150mm，5µm，85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃

硅胶纯度

初始的硅胶基质，酸洗后的硅胶基质，流动相：20mM三甲胺

金属污染C18硅胶造成的碱性药物的拖尾

2、柱外效应

色谱柱：150×0.45mm, 硅胶柱

流动相：Hexane-CAN(99:1,V/V)

流 速：2.0mL/min

(a) 10µL进样阀与8µL检测器流，通池的商品色谱仪

(b) 0.5µL进样阀与1µL检测器流通池的商品色谱仪

柱外效应造成的色谱峰拖尾

3、溶剂效应

样品进样过程的溶剂效应(液相与质谱)

样品体积：30µL

流 动 相：18% 乙腈-H2O

分别以纯乙腈和流动相为溶剂注 入咖啡因(A峰)与水扬酸胺(B峰)样品

解决方法：

1、使用流动相溶解样品

2、加大浓度，降低进样量

样品溶剂进样的影响

4、样品特性

葡萄糖端基异构体的转化— 两个峰

提高温度，或提高pH值，转化加快 一个峰

色谱柱：Venusil HILIC 5µm 4.6×250mm;流动相：乙腈-水 (80: 20);柱温：30℃ ;检测器：蒸发光散射检测器;样品：葡萄糖对照品水溶液，流速：1mL/min

5、柱外效应对峰形/分离度的影响

死体积是指从进样器到检测器的体积，这一段没有被色谱填料所填充的部分，死体积大，会导致峰展宽，峰形变差等等。

6、柱外效应对峰形/分离度的影响

尽量减小连接管路体积。尤其使用窄径柱时!

柱后和检测器之间标配一个两道，去掉后测试明显改善

7、柱外效应主要影响N值

进样量大主要引起柱子超载，保留时间和N值下降，一般凭经验找到是保留时间和N***大的进样量。一般：0.46mm的色谱柱***大进样量为10-50ug。一般开始时大样品量进样(10-50ug)，然后逐渐降低进样量直至保留时间稳定。

8、色谱峰拖尾/扩展/分裂

色谱柱污染：复杂样品基体或待测样品量大

颗粒物堵塞筛板：复杂样品基体或待测样品量大

色谱柱死体积：流动相pH>7时，硅胶溶解(除非使用特殊色谱柱)，死体积增加。

样品溶剂效应：样品溶剂强于流动相-裂分峰和扩展峰取决于样品量

三 . 色谱峰保留值

1、保留时间变化

漂移(单方向增加或减小 )波动(无规律的变化)

2、保留时间变化原因

色谱柱平衡、固定相变化、色谱柱污染、流动相组成发生变化、疏水坍塌

3、色谱柱平衡

流动相变化(梯度洗脱的平衡)、温度变化、流速变化、更换色谱柱

至少使用10-20倍柱体积流动相平衡色谱柱

4、固定相变化

键合相流失：通常保留时间变短，使用耐酸色谱柱：venusil ASB C18和C8系列

硅胶溶解：裂峰，使用耐碱的色谱柱：Durashell C18 ，RP

5、色谱柱污染

清洗：合适的清洗方式

使用保护柱：请特别注意何时更换保护柱、压力、分离效果、时间、进样次数几个方面。

6、流动相组成发生变化

易挥发性组分挥发：夏天，注意密闭容器，不建议循环使用流动相一相小于10%的在线混合正确配置流动相(V:V)

7、疏水坍塌

C18色谱柱，若没有指明，不得使用100%水作为流动相 (至少含有5%的有机相)使用亲水色谱柱(若水相必须大于95%)：Venusil MP C18、Venusil HLP、Venusil ASB C18，C8

8、建立良好重现性方法

选用质量好的色谱柱、 选用良好的流动相体系、用流动相充分平衡柱子(如MP中含THF，三乙基胺或四丁基铵等胺类调节剂或离子对试剂，特别是烷基上有十个以上的碳原子的情况!)、 采用合适的试验技术，确保日间稳定、 预存色谱柱

四. 色谱柱柱寿命

1、色谱柱的寿命应有多长

a、操作者对色谱柱的使用和处理

b、注入样品的类型

c、干净样品：进样至少2000次。

保证良好柱寿命与性能的方法

总体来说色谱柱常见问题症状是柱压过高、峰形不好、保留时间不稳。一般来说色谱柱常见问题原因如下：

色谱柱筛板问题-筛板或柱床部分堵塞;

强保留的样品组分-吸附样品杂质(污物);

色谱柱填充不好;

柱压问题-机械或热冲击造成空洞

化学影响-基质或键合相被化学侵蚀