FITC抗体标记实验荧光素标记抗体步骤

1、准备好凝胶滤柱以便完成结合反应后用于分离标记抗体和游离的荧光色素。分离球形蛋白使用排除极限为 20000 ～ 50000 的凝胶介质和细粒级凝胶(直径约 50 μm )。所需凝胶滤柱的大小可根据偶联反应的总体积× 20 来确定。依据厂家说明准备好滤柱，用 20 倍柱床体积的 PBS 灌注滤柱，直至缓冲液水平刚好降至低于柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或用塑膜黏土(或parafilm)封闭底端以使滤柱不再流动。

2、用0.1mol/L 的硼酸钠或碳酸钠配制浓度至少为2mg/ml 的抗体溶液(pH9.0)。应避免引入含一级胺的外来分子。

3、用无水 DMSO(优级纯)溶解 FITC 至 1mg/ml 。每次标记反应时新鲜配制。

4、每 1ml 蛋白溶液加 50 μL染液。染液须以每次 5 μL缓慢加入，加入时应轻轻地连续搅拌混匀。

5、置 4℃避光反应1h 。

6、加氯化铵至 50mmol/L ，室温孵育 2h 。加入 0.1%二甲苯氰和 5%甘油。

7、通过凝胶过滤分离结合物与未结合的染料。小心地将偶联反应产物加在滤柱顶部，打开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再小心地将 PBS 加在滤柱顶部并与缓冲液供应装置连接。结合染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。

8将洗脱液的结合物 4℃贮存于避光容器，必要时加入 0.02%叠氮钠。

9进行荧光素偶联反应时，应通过测量 495nm 和 280nm 波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，荧光素的吸光值比例(496nm/280nm)应在0.3 ～ 1.0之间，低于上述比率将导致低信号，高比率则出现高背景。若比率太低，应使用低浓度抗体与高浓度染料重复结合;若比率太高，则可适当调整后重新标记，或通过 DEAE 离子交换层析柱进一步纯化抗体。用 10mmol/L 磷酸钾( pH8.0 )平衡并灌注滤柱，通过增加盐浓度进行梯度洗脱。测量每一组分的吸光值比率(495/280 或 550/280)，选取适当组分合并。