NHS 活化酯 (SE)NHS，全称为 N -羟基琥珀酰亚胺酯，是 EDC (碳二亚胺) 活化羧酸分子形成的反应基团。带有活化的 NHS 酯的交联剂 和标记化合物在弱碱性条件下与伯胺反应， 产生稳定的酰胺键 。该反应释放 N-羟 基琥珀酰亚胺 (NHS)，可通过透析或脱盐轻易去除。

(R)表示具有 NHS 反应基团的标记试剂或交联剂的一端; (P) 表示含有靶标功能基团 (即氨基，–NH) 的蛋白质或其他分子。

蛋白巯基反应，巯基 (-SH) 存在于半胱氨酸的侧链中。在进行交联反应时，必须将其还原成巯基，使其可以与大多数类型的反应基团进行交联。巯基对马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶二巯基具有反应活性，在蛋白巯基标记中，马来酰亚胺的荧光探针***为常见。

马来酰亚胺(Maleimides) 马来酰亚胺是一种非常常用的反应活化基团，当反应混合物的 pH 值在 6.5-7.5 之间时，马来酰亚氨基团会与巯基基团特异性反应，形成不可逆的稳定硫醚键。在碱性更强的条件下(pH>8.5)，支持伯胺偶联，并且还会增加马来酰亚氨基团水解成非反应性马来酰胺酸的速率。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或蛋氨酸反应。需要注意的是，马来酰亚胺酯是一种非活化染料，使用带有马来酰亚胺酯的荧光探针时，需用 DTT 活化后方可进行后续标记。

(R) 表示具有马来酰亚胺反 应基团的标记试剂或交联剂的一端; (P) 表示含有靶标功能基团 (即巯基，– SH) 的蛋白质或其他分子。