Cy3-NHS Ester 标记抗体

1、用不含氨基的合适的缓冲液(eg.100mM磷酸钠，150mM NaCl, pH7.5)溶解抗体使其浓度达到1-5mg/mL。【注】：如抗体中有残留Tris或 glycine 污染，则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。

2、使用前，用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍，例如，待标记的IgG浓度为1mg/mL(eg 6.7µM)，则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM;如待标记的IgG浓度为2.5mg/mL，则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM。

3、向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂，以达到预期的标记效率。【注】：当用Cy3 NHS ester标记抗体或其他蛋白，亮度***高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12，取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景，丧失抗体特异性结合，导致聚集。建议根据应用优化标记比率。

4、室温孵育60min(或更长)。

5、利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂。

6、分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值。

7、测定Cy3标记效率(DOL)和标记浓度。

注意：可参考本方法进行多肽，蛋白或者其他分子的标记，需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系，样本浓度，染料浓度等参数做出合适的调整。以上科研试剂，我们均可以提供。

应用举例

用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记 0.1 mL山羊IgG(浓度为1mg/mL)。标记后脱盐去除未标记染料，在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:

A280=0.2906

A555=0.9825

另：山羊IgG分子量为150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1

计算DOL如下：

By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM

By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM

By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3

则计算Cy3-IgG protein 浓度为(mg/mL)：

By Equation 4 mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL