细胞增殖和细胞死亡间平衡的维持对多种细胞有机的发育与生命的维持至关重要，其失衡将导致各种疾病的发生.如：人类平均每天有 6×10(10)个新细胞生成，同时又接近同等数量的成熟细胞被机体清除.在细胞增殖及细胞凋亡间存在一种配对关系，因此区分活细胞和死细胞对研究生长条件的控制和细胞死亡过程都是十分重要的。

一.试剂准备：

A. 活细胞-绿色染料(LiveDye)：冰上避光放置。

B. 死细胞-红色染料(NucleiDye)：冰上避光放置。

C. 实验缓冲液 (10×) [Assay Buffer(10×)]：用 ddH20 稀释 10x 实验缓冲液，至 1x 实验缓冲液(工作液)。使用前预热到 37C。

D. 染色工作液：每 1 ml 的实验缓冲液(1X)中，加入 1ul 活细胞-绿色染料(LiveDye)和 1ul 死细胞-红色染料(NucleiDye)，混合均匀(适用于2个样品孔，每孔0.5ml)。如有大量样品，请成比例的扩大染色工作液配置。

二.(一)荧光显微镜：

1. 用预期的方法处理细胞，在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组;

2. 对于贴壁细胞，在 24 孔板的盖玻片上种植和培育细胞，在 CO2 细胞培养箱中 37°C 培养至少 24 小时。先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞，之后离心收集细胞(1000 rpm，3 min)。

对于悬浮细胞，直接离心(4℃, 300g, 5 min)收集细胞。

3. 用 PBS 洗涤细胞两次，移除液体。

4. 在 24 孔板中，每个孔加入 0.5ml 染色工作液来，37℃避光孵育 15-30 min。

5. 用 PBS 洗涤细胞两次。

6. 将盖玻片覆盖到载玻片上，尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。

为了获得更佳效果，可以使用抗荧光淬灭剂对其进行观察。

(二)流式细胞分析：

1. 用预期的方法处理细胞

对于所有的处理和未处理的细胞样本，建议把未染色的对照组细胞悬浮在实验缓冲液(不含有 LiveDye 和 NucleiDye)，用于流式细胞分析;

2. 对于非贴壁细胞，收集 1-5 ×105 个细胞离心 (4℃, 300g, 5 min)，用预冷的 PBS 洗涤2 次，弃去 PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶(不含 EDTA)消化细胞，然后离心去上清。

3. 用 500ul 染色工作液来悬浮细胞。

4. 避光孵育 15-30 min。

5. 使用流式细胞仪进行相应检测与分析。