核酸-脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂及其制备方法和应用与流程
发布时间：2024-03-29 分享至：
新型冠状病毒肺炎（covid-19）疫情中，mrna疫苗具有安全、免疫应答高和生产成本低的优势，同时获得美国和欧盟紧急获批上市。近年来，研究发现由mrna诱导的瞬时蛋白表达在其他传染病疫苗、癌症疫苗、心血管疾病、蛋白质替代疗法和遗传病等多领域均具有巨大的应用价值，甚至能够通过体内注射实现自主产生car-t效应。然而，与绝大多数疫苗的储存条件（2-8℃）不同，已上市mrna疫苗长期稳定性差，需超低温保存（-20℃，甚至-70℃），且有效期低于6个月。在面临数亿剂mrna疫苗需要储存，运输和分发到世界各地的情况下，稳定性成为其应用的瓶颈问题。
3.首先，mrna链长为1000至5000个碱基长度，早期研究中已发现裸mrna会被核糖核酸酶（rnase）迅速水解，而rnase无处不在，体内外均有大量附着，需要特殊处理才能去除。除此之外，mrna长链上仅一个变化（键断裂或碱基的氧化）即会终止翻译，故mrna疫苗中mrna分子的完整性至关重要。
4.在mrna疫苗中为了提高mrna体内作用效力，以lnp包载递送mrna，不仅保护mrna避免被体内rnase瞬时破坏，而且突破mrna与细胞膜均带负电荷的静电排斥屏障，增强向抗原递呈细胞的递送。然而，mrna-lnp注射液长期稳定性不佳，与其相反，sirna-lnp注射液稳定性良好：onpattro与mrna-1273中的lnp十分相似，却具有2-8℃，3年有效期。除此之外，suzuki等构建的sirna-lnp注射液4 ℃放置1.5年，稳定性良好。sirna分子量小且为双链结构，mrna链长超过sirna 100倍以上且为单链结构，后者分子结构更不稳定，更易发生水解，上述研究表明lnp在注射液中不能起到保护mrna长期稳定的作用。
5.lnp由四种主要成分组成：中性磷脂、胆固醇、聚乙二醇（peg）-脂质和可电离阳离子脂质。研究发现mrna-lnp为核-壳结构，具有表面层和一个无定形、各向同性的核心。viger gra等利用nmr波谱发现两种类型的核心是可能的：无定形核包含被阳离子脂质包围的水孔；或核心中的脂质可以均匀分散，中间有小水袋。arteta等和sebastiani等发现中性磷脂和peg脂质以及部分可电离阳离子脂质和胆固醇位于lnp表面，而可电离阳离子脂质、胆固醇、水和mrna位于核心区域。研究表明lnp核心含水24%，mrna位于被阳离子脂质包围的水柱内。
6.冷冻干燥，又称升华干燥，根据水的三相图将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。近年来，冻干产品占fda和ema批准生物药品的一半以上。在纳米制剂领域，ambisome®和vyxeos®均为冻干脂质体制剂，二者保质期可达36个月。辉瑞病毒疫苗研究主管dormitzer表示公司有意开发mrna-lnp冻干制剂。然而，目前关于mrna-lnp冻干条件的研究很少，虽然均为纳米制剂，但脂质体是磷
脂双分子层形成的闭合囊泡，且用于冻干的脂质体包载的皆为小分子药物；mrna-lnp为壳-核结构，外层仅为磷脂单分子层，核心包载的mrna不仅分子量大，且对于mrna分子的完整性要求极高，mrna-lnp需要在真空冷冻干燥的高强度压力变化过程中，保持其磷脂层和纳米结构不被破坏，保证mrna的包载状态不发生变化，并在复水重构后恢复原液粒径分布及mrna包封率，这些都具有很高的挑战性。zhao等制备了一种新型类脂质纳米颗粒用于mrna递送的冻干制剂，虽然mrna复水制剂与原液体外细胞活性无显著差异，但却不具备体内活性，尚不清楚原因。ai lx等以lnp分别包载sars-cov-2 野生型、delta株和omicron株的s蛋白mrna序列，可于4℃、25℃和40℃储存18天，muramatsu等制备了mrna-lnp冻干制剂，可于4℃储存24周，且体内外生物活性无显著差异。可见不同冻干条件制备的mrna疫苗体内生物活性差异极大，提示不同的冻干程序曲线和保护剂对于制剂性能有很大影响，但对其中的作用机理和规律尚未见文献报道。
7.冷冻干燥工艺主要包括冻干程序曲线和保护剂两方面内容。冻干程序曲线是冻干过程中的温度、真空度及能量等随时间变化的曲线，一般包括三个阶段：预冻，升华干燥和解吸干燥。其中，冷却温度、升温速率及维持时长等均对于冻干粉的外观、水分、粒径等有重要影响。冻干保护剂，如蔗糖、海藻糖、乳糖和甘露醇等，可于干燥脱水过程中取代脂质分子与水分子间的氢键来稳定lnp结构，并起到赋形剂的作用。冻干保护剂种类、用量及添加顺序，均使其与mrna-lnp的分子作用机制及微观空间作用不同，对冻干粉中的lnp膜结构，mrna包封率，mrna完整性等有很大影响。综上所述，冻干程序曲线和保护剂对mrna-lnp冻干粉的微观结构、关键理化性质及生物活性的影响，亟需深入探究。
8.现有技术中的冻干工艺关键参数常为“经验式”应用，一般冷冻干燥工艺从预冻至解析干燥结束，需要30-100小时，耗费能源是一个方面，另一方面也大大增加了产品放大生产的时间成本，如发明专利cn 110714015 b中优选的冻干程序为“预冻温度为-50℃,温度保持5小时。一次冻干温度为-40℃ 24小时，二次冻干温度为10℃保持17小时，冻干过程真空度为40μbar。”共耗时46小时。muramatsu等制备mrna-lnp冻干制剂的冷冻干燥程序共耗时84小时。
3.首先，mrna链长为1000至5000个碱基长度，早期研究中已发现裸mrna会被核糖核酸酶（rnase）迅速水解，而rnase无处不在，体内外均有大量附着，需要特殊处理才能去除。除此之外，mrna长链上仅一个变化（键断裂或碱基的氧化）即会终止翻译，故mrna疫苗中mrna分子的完整性至关重要。
4.在mrna疫苗中为了提高mrna体内作用效力，以lnp包载递送mrna，不仅保护mrna避免被体内rnase瞬时破坏，而且突破mrna与细胞膜均带负电荷的静电排斥屏障，增强向抗原递呈细胞的递送。然而，mrna-lnp注射液长期稳定性不佳，与其相反，sirna-lnp注射液稳定性良好：onpattro与mrna-1273中的lnp十分相似，却具有2-8℃，3年有效期。除此之外，suzuki等构建的sirna-lnp注射液4 ℃放置1.5年，稳定性良好。sirna分子量小且为双链结构，mrna链长超过sirna 100倍以上且为单链结构，后者分子结构更不稳定，更易发生水解，上述研究表明lnp在注射液中不能起到保护mrna长期稳定的作用。
5.lnp由四种主要成分组成：中性磷脂、胆固醇、聚乙二醇（peg）-脂质和可电离阳离子脂质。研究发现mrna-lnp为核-壳结构，具有表面层和一个无定形、各向同性的核心。viger gra等利用nmr波谱发现两种类型的核心是可能的：无定形核包含被阳离子脂质包围的水孔；或核心中的脂质可以均匀分散，中间有小水袋。arteta等和sebastiani等发现中性磷脂和peg脂质以及部分可电离阳离子脂质和胆固醇位于lnp表面，而可电离阳离子脂质、胆固醇、水和mrna位于核心区域。研究表明lnp核心含水24%，mrna位于被阳离子脂质包围的水柱内。
6.冷冻干燥，又称升华干燥，根据水的三相图将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。近年来，冻干产品占fda和ema批准生物药品的一半以上。在纳米制剂领域，ambisome®和vyxeos®均为冻干脂质体制剂，二者保质期可达36个月。辉瑞病毒疫苗研究主管dormitzer表示公司有意开发mrna-lnp冻干制剂。然而，目前关于mrna-lnp冻干条件的研究很少，虽然均为纳米制剂，但脂质体是磷
脂双分子层形成的闭合囊泡，且用于冻干的脂质体包载的皆为小分子药物；mrna-lnp为壳-核结构，外层仅为磷脂单分子层，核心包载的mrna不仅分子量大，且对于mrna分子的完整性要求极高，mrna-lnp需要在真空冷冻干燥的高强度压力变化过程中，保持其磷脂层和纳米结构不被破坏，保证mrna的包载状态不发生变化，并在复水重构后恢复原液粒径分布及mrna包封率，这些都具有很高的挑战性。zhao等制备了一种新型类脂质纳米颗粒用于mrna递送的冻干制剂，虽然mrna复水制剂与原液体外细胞活性无显著差异，但却不具备体内活性，尚不清楚原因。ai lx等以lnp分别包载sars-cov-2 野生型、delta株和omicron株的s蛋白mrna序列，可于4℃、25℃和40℃储存18天，muramatsu等制备了mrna-lnp冻干制剂，可于4℃储存24周，且体内外生物活性无显著差异。可见不同冻干条件制备的mrna疫苗体内生物活性差异极大，提示不同的冻干程序曲线和保护剂对于制剂性能有很大影响，但对其中的作用机理和规律尚未见文献报道。
7.冷冻干燥工艺主要包括冻干程序曲线和保护剂两方面内容。冻干程序曲线是冻干过程中的温度、真空度及能量等随时间变化的曲线，一般包括三个阶段：预冻，升华干燥和解吸干燥。其中，冷却温度、升温速率及维持时长等均对于冻干粉的外观、水分、粒径等有重要影响。冻干保护剂，如蔗糖、海藻糖、乳糖和甘露醇等，可于干燥脱水过程中取代脂质分子与水分子间的氢键来稳定lnp结构，并起到赋形剂的作用。冻干保护剂种类、用量及添加顺序，均使其与mrna-lnp的分子作用机制及微观空间作用不同，对冻干粉中的lnp膜结构，mrna包封率，mrna完整性等有很大影响。综上所述，冻干程序曲线和保护剂对mrna-lnp冻干粉的微观结构、关键理化性质及生物活性的影响，亟需深入探究。
8.现有技术中的冻干工艺关键参数常为“经验式”应用，一般冷冻干燥工艺从预冻至解析干燥结束，需要30-100小时，耗费能源是一个方面，另一方面也大大增加了产品放大生产的时间成本，如发明专利cn 110714015 b中优选的冻干程序为“预冻温度为-50℃,温度保持5小时。一次冻干温度为-40℃ 24小时，二次冻干温度为10℃保持17小时，冻干过程真空度为40μbar。”共耗时46小时。muramatsu等制备mrna-lnp冻干制剂的冷冻干燥程序共耗时84小时。