1.本发明属于药物领域，具体地，涉及一种偶联抗体脂质体。


背景技术：

2.脂质体药物国内外均有多个产品上市，特别是包载抗肿瘤化疗药物如阿霉素、伊立替康、紫杉醇等的脂质体制剂产品，一方面能够通过包载药物改变其体内分布和循环特性，另一方面可以通过epr效应提高药物在肿瘤组织中蓄积的浓度(被动靶向作用)，通过提高药效和/或降低毒副作用，使治疗指数(therapeutic index)明显改善。但是，由于传统的脂质体缺乏与肿瘤细胞的特异性相互作用，脂质体中的药物需要从脂质体中释放后才能被肿瘤细胞所摄取，并不能全部被利用，并不能***大程度地提升药效，因此，限定了脂质体的应用。
3.因此，本领域需要开发一种对肿瘤进行有效治疗的脂质体。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种对肿瘤进行有效治疗的脂质体。
5.本发明***方面，提供一种纳米颗粒，所述的纳米颗粒的表面含有抗体；
6.所述抗体的个数为5-60个，较佳地5-50个，更佳地5-40个。
7.在另一优选例中，所述抗体的个数为5-30个，较佳地5-25个，较佳地5-20个，更佳地5-15个，更佳地8-12个，***佳地10个。
8.在另一优选例中，所述抗体的个数为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个。
9.在另一优选例中，所述的纳米颗粒的外表面含有抗体
10.在另一优选例中，所述的抗体与所述的纳米材料偶联。
11.在另一优选例中，所述的纳米材料包括脂质材料。
12.在另一优选例中，所述的抗体包括her2抗体(人类表皮生长因子受体2抗体)。
13.在另一优选例中，所述的her2抗体包括her2抗体的fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
14.在另一优选例中，所述her2抗体的fab片段包括重链和轻链；
15.所述重链选自下组：
16.(1)seq id no.:1所示的氨基酸序列；
17.(2)将seq id no.:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的；
18.(3)具有与seq id no.:1所示氨基酸序列≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％同源性；
19.所述轻链选自下组：
20.(a)seq id no.:2所示的氨基酸序列；
21.(b)将seq id no.:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的；
22.(c)具有与seq id no.:2所示氨基酸序列≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％同源性。
23.在另一优选例中，所述的纳米颗粒为脂质体或纳米粒。
24.在另一优选例中，所述纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
25.在另一优选例中，所述脂质体为负载药物的脂质体。
26.在另一优选例中，所述纳米粒为负载药物的纳米粒。
27.在另一优选例中，所述的负载包括药物被包裹在纳米颗粒(如脂质体或纳米粒)中。
28.在另一优选例中，所述药物包括抗肿瘤药物。
29.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物选自下组：蒽环类药物、铂类药物、氟尿嘧啶类药物、喜树碱类药物、紫杉类药物或其组合。
30.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物包括多柔比星。
31.在另一优选例中，所述的脂质体包括脂质材料。
32.在另一优选例中，所述的脂质材料为脂质体的脂质双分子层材料。
33.在另一优选例中，所述的脂质材料包括氢化大豆磷脂(hspc)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg)、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇、聚乙二醇甘油脂肪酸酯和聚乙二醇甘油磷酰乙醇胺中的一种或多种。
34.在另一优选例中，所述的抗体与所述的脂质材料偶联。
35.在另一优选例中，所述的抗体与所述的dspe-mpeg偶联。
36.在另一优选例中，所述的dspe-mpeg包括dspe-mpeg2000。
37.在另一优选例中，所述her2抗体的重链第229位的半胱氨酸上的游离巯基与dspe-mpeg偶联。
38.在另一优选例中，所述的偶联的方法包括：
39.dspe-peg与马来酰亚胺反应生成dspe-peg-mal，然后dspe-peg-mal的马来酰亚胺基团与her2抗体的重链第229位的半胱氨酸上的游离巯基反应，得到her2抗体与dspe-peg偶联。
40.在另一优选例中，所述的纳米颗粒的粒径为60-250nm。
41.在另一优选例中，所述的纳米颗粒的粒径为80～120nm。
42.在另一优选例中，所述的脂质体中，所述药物与所述脂质材料的重量比(药脂比)为0.02-0.1，较佳为0.022-0.085，更佳地0.025-0.05，更佳地0.028-0.04，更佳地0.033-0.037。
43.在另一优选例中，所述脂质体为负载药物的脂质体，所述的脂质体中，所述药物与所述脂质材料的重量比(药脂比)为1:25-35，较佳为1:28-32。
44.在另一优选例中，所述的脂质体通过以下方法制备：
45.(i)将脂质材料加入到有机溶剂混合，得到脂质混合液；
46.(ii)将所述的脂质混合液加入到水相，得到空白脂质体溶液。
47.(iii)将药物溶液加入到空白脂质体溶液中，孵育，得到负载药物的脂质体；
48.(iv)将偶联抗体的脂质材料与所述负载药物的脂质体混合，孵育，得到脂质体。
49.在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述的脂质材料选自下组：氢化大豆磷脂(hspc)、胆固醇(chol)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg)，或其组合。
50.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与所述胆固醇(chol)的重量比为2-4:1。
51.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg)的重量比为3-20:1。
52.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg)的重量比为13-17:1。
53.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述的有机溶剂包括乙醇。
54.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述的水相为水或硫酸铵水溶液。
55.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述硫酸铵水溶液的浓度为100-450mm。
56.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述硫酸铵水溶液的浓度为150-270mm
57.在另一优选例中，所述硫酸铵水溶液的ph为4.0-6.0。
58.在另一优选例中，所述硫酸铵水溶液的ph为4.8-5.2。
59.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，将所述的脂质混合液加入到水相，搅拌挤出，然后透析，得到空白脂质体溶液。
60.在另一优选例中，所述的透析在hepes缓冲液(8-12mm，ph为6.6-6.8)中进行。
61.在另一优选例中，所述的有机溶剂与所述水相的体积比为1:8-12。
62.在另一优选例中，所述步骤(iii)中，所述药物与所述空白脂质体的重量比(药脂比)为0.02-0.1，较佳为0.022-0.085，更佳地0.025-0.05，更佳地0.028-0.04，更佳地0.033-0.037。
63.在另一优选例中，所述步骤(iii)中，所述药物与所述空白脂质体的重量比(药脂比)为1:25-35，较佳为1:28-32。
64.本发明第二方面，提供一种组合物，所述的组合物包括如本发明***方面所述的纳米颗粒。
65.在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
66.在另一优选例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
67.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服制剂、注射制剂或外用制剂。
68.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
69.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
70.在另一优选例中，所述注射剂选自：液体制剂、混悬液制剂、冻干粉针剂。
71.在另一优选例中，所述注射剂给药方式选自：静脉注射、皮下注射、原位注射。
72.本发明第三方面，提供一种如本发明***方面所述的纳米颗粒或如本发明第二方面所述的组合物的用途，用于制备药物，所述的药物用于预防和/或治疗肿瘤。
73.在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌，或其组合。
74.在另一优选例中，所述的肿瘤包括受体表达肿瘤。
75.在另一优选例中，所述受体包括her2。
76.在另一优选例中，所述的受体与所述的抗体结合。
77.在另一优选例中，所述结合包括特异性结合。
78.在另一优选例中，所述的肿瘤包括her2高表达肿瘤。
79.在另一优选例中，所述的her2高表达指与正常细胞的her2表达a0相比，肿瘤细胞的her2表达a1，且a1/a0＞1.2，较佳地＞1.5。
80.在另一优选例中，所述的肿瘤包括对抗肿瘤药物多药耐药性的肿瘤。
81.本发明第四方面，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，对所需对象施用如如本发明***方面所述的纳米颗粒或如本发明第二方面所述的组合物。
82.在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
83.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
84.图1a为非还原性sds-page检测her2fab与dspe-peg2000-mal连接结果。
85.图1b为rp-hplc检测her2fab与dspe-peg2000-mal连接结果。
86.图1c为非还原性sds-page检测aher2-dspe纯化结果。
87.图1d为rp-hplc检测aher2-dspe纯化结果。
88.图2为插入不同抗体数量的多柔比星脂质体(aher2-ldx)粒径分布图，其中，图2a、2b和2c分别为抗体数量为10、20、40的aher2-ldx粒径分布图。
89.图3为sepharose4b凝胶柱检测aher2-dspe后插入ldx中后插效率。
90.图4为流式细胞术检测sk-br-3、bt474、nci-n87、mda-mb-453、mcf-7、mda-mb-231、mgc-803、a2780表面的her2抗原表达情况，其中，rmfi表示相对平均荧光强度。
91.图5a为10-caher2-ldx、20-caher2-ldx、10-baher2-ldx、20-baher2-ldx和a-ldx在her2高表达细胞系sk-br-3中抑制肿瘤细胞生长的情况。
92.图5b为10-caher2-ldx、20-caher2-ldx、10-baher2-ldx、20-baher2-ldx和a-ldx在her2高表达细胞系nci-n87中抑制肿瘤细胞生长的情况。
93.图5c为10-caher2-ldx、20-caher2-ldx、10-baher2-ldx、20-baher2-ldx和a-ldx在her2高表达细胞系bt474中抑制肿瘤细胞生长的情况。
94.图6为gator非标记生物分析仪检测her2抗体免疫脂质体的亲和活性。左侧为脂质浓度0.5mg/ml的情况，右侧为脂质浓度为1mg/ml的情况。
95.图7a为不同抗体密度her2fab免疫荧光脂质体aher2dii-lip与her2高表达细胞系sk-br-3体外结合强度情况。其中，aher2dii-lip-3代表荧光标记的偶联3个her2fab抗体片段的aher2-ldx，以此类推。
96.图7b为不同抗体密度her2fab免疫荧光脂质体aher2dii-lip与her2阴性细胞系mda-mb-231体外结合强度情况，aher2dii-lip-3代表荧光标记的偶联3个her2fab抗体片段的aher2-ldx，以此类推。
97.图8为her2抗体偶联的多柔比星脂质体被her2高表达细胞系bt474摄取并释放药物的情况。
98.图9为her2fab抗体靶向的多柔比星脂质体对阿霉素耐药乳腺癌细胞mcf-7/adr的细胞杀伤作用
99.图10为aher2-ldx在her2高表达的bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型中的药效情况。
100.图11为aher2-ldx在her2高表达的nci-n87胃癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型中的药效情况。
101.图12为aher2-ldx在her2低表达的mcf-7乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型中的药效情况。
102.图13a为aher2-ldx在bt474荷瘤小鼠体内多柔比星药物的药代动力学情况。
103.图13b为aher2-ldx在bt474荷瘤小鼠体内her2fab的药代动力学情况。
具体实施方式
104.本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种纳米颗粒如脂质体，所述的纳米颗粒的表面含有抗体。实施例研究表明，脂质体表面含有10-40个脂质体时能够更有效发挥对肿瘤治疗效果且改善肿瘤的多药耐药性。在此基础上，完成了本发明。
105.术语
106.如本文所用，“本发明的药物组合物”指的是包含抗肿瘤药物以及脂质体的药物组合物，且该组合物的药脂比在0.01-0.15的范围内，优选的为0.02-0.1。
107.如本文所用，人类表皮生长因子受体2(英文名：human epidermal growth factor receptor 2，缩写为her2、aher2或her2，亦称为neu或her2/neu。
108.如本文所用，各个细胞株的代表名称如下表a所示：
109.表a细胞株
110.细胞株描述sk-br-3人乳腺癌细胞系bt474人乳腺癌细胞系nci-n87人胃癌细胞系mda-mb-231人三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-453人乳腺癌细胞系mcf-7人乳腺癌细胞系a2780人卵巢癌细胞系mgc-803人胃癌细胞系
111.抗体
112.在本发明的一个优选例中，本发明所述的抗体包括her2抗体(人类表皮生长因子受体2抗体)。
113.一个完整的抗体的基础单元结构有四条肽链组成，包括两条重链和两条轻链，并通过二硫键结合在一起。抗体的形状像一个y字母，y结构的铰链区具有弹性。每条肽链就有一个恒定区(在所有的抗体中都非常的保守)和一条可变区(在一个种抗体中都是特异性的)。轻链可变区的标示符号是vl，而轻链恒定区的标示符号是cl。类似的，重链的可变区和恒定区分别被标示为(vh)和(ch)。碳水化合物通常和重链的ch2区域结合。fc段只包括重链
的恒定区(ch)，但是和抗原结合的fab段(fab)包括重链的可变区以及轻链的可变区以及与重链的可变区以及轻链的可变区相连的一个恒定区。
114.在本发明的一个优选例中，所述的her2抗体包括her2抗体的fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
115.代表性对，所述her2抗体的fab片段包括重链和轻链；
116.所述重链选自下组：
117.(1)seq id no.:1所示的氨基酸序列；
118.(2)将seq id no.:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的；
119.(3)具有与seq id no.:1所示氨基酸序列≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％同源性；
120.所述轻链选自下组：
121.(a)seq id no.:2所示的氨基酸序列；
122.(b)将seq id no.:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的；
123.(c)具有与seq id no.:2所示氨基酸序列≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％同源性。
124.纳米颗粒
125.本发明提供一种纳米颗粒，所述的纳米颗粒的表面含有抗体；
126.所述抗体的个数为5-60个，较佳地5-50个，更佳地5-40个。
127.在本发明的一个优选例中，所述抗体的个数为5-30个，较佳地5-25个，较佳地5-20个，更佳地5-15个，更佳地8-12个，***佳地10个。
128.代表性地，所述抗体的个数为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个。
129.在本发明的一个优选例中，所述的纳米颗粒的外表面含有抗体
130.在本发明的一个优选例中，所述的抗体与所述的纳米材料偶联。
131.在本发明的一个优选例中，所述的纳米材料包括脂质材料。
132.在本发明的一个优选例中，所述的纳米颗粒为脂质体或纳米粒。
133.在另一优选例中，所述纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
134.在另一优选例中，所述脂质体为负载药物的脂质体。
135.在另一优选例中，所述纳米粒为负载药物的纳米粒。
136.在本发明的一个优选例中，所述的负载包括药物被包裹在纳米颗粒(如脂质体或纳米粒)中。
137.在本发明的一个优选例中，所述药物包括抗肿瘤药物。
138.代表性地，所述抗肿瘤药物选自下组：蒽环类药物、铂类药物、氟尿嘧啶类药物、喜树碱类药物、紫杉类药物或其组合。
139.代表性地，所述抗肿瘤药物包括多柔比星。
140.在本发明的一个优选例中，所述的脂质体包括脂质材料。
141.在本发明的一个优选例中，所述的脂质材料为脂质体的脂质双分子层材料。
142.代表性地，所述的脂质材料包括氢化大豆磷脂(hspc)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇、聚乙二醇甘油脂肪酸酯和聚乙二醇甘油磷酰乙醇胺中的一种或多种。
143.在本发明的一个优选例中，所述的抗体与所述的脂质材料偶联。
144.代表性地，所述的抗体与所述的dspe-peg偶联。
145.代表性地，所述her2抗体的重链第229位的半胱氨酸上的游离巯基与dspe-peg偶联。
146.在本发明的一个优选例中，所述的偶联的方法包括：
147.dspe-peg与马来酰亚胺反应生成dspe-peg-mal，然后dspe-peg-mal的马来酰亚胺基团与her2抗体的重链第229位的半胱氨酸上的游离巯基反应，得到her2抗体与dspe-peg偶联。
148.在另一优选例中，所述的纳米颗粒的粒径为60～250nm。
149.在另一优选例中，所述的纳米颗粒的粒径为80～100nm
150.在本发明的一个优选例中，所述的脂质体中，所述药物与所述脂质材料的重量比(药脂比)为0.02-0.1，较佳为0.022-0.085，更佳地0.025-0.05，更佳地0.028-0.04，更佳地0.033-0.037。
151.在本发明的一个优选例中，所述的脂质体中，所述药物与所述脂质材料的重量比(药脂比)为1:25-35，较佳为1:28-32。
152.在本发明的一个优选例中，所述的脂质体通过以下方法制备：
153.(i)将脂质材料加入到有机溶剂混合，得到脂质混合液；
154.(ii)将所述的脂质混合液加入到水相，得到空白脂质体溶液。
155.(iii)将药物溶液加入到空白脂质体溶液中，孵育，得到负载药物的脂质体；
156.(iv)将偶联抗体的脂质材料与所述负载药物的脂质体混合，孵育，得到脂质体。
157.在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述的脂质材料选自下组：氢化大豆磷脂(hspc)、胆固醇(chol)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)，或其组合。
158.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与所述胆固醇(chol)的重量比为2-4:1。
159.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)的重量比为3-20:1。
160.在另一优选例中，所述的氢化大豆磷脂(hspc)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)的重量比为15-17:1。
161.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述的有机溶剂包括乙醇。
162.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述的水相为水或硫酸铵水溶液。
163.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述硫酸铵水溶液的浓度为100-450mm。
164.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述硫酸铵水溶液的浓度为230-270mm
165.在另一优选例中，所述硫酸铵水溶液的ph为4.0-6.0。
166.在另一优选例中，所述硫酸铵水溶液的ph为4.8-5.2。
167.在另一优选例中，所述步骤(ii)中，将所述的脂质混合液加入到水相，搅拌挤出，然后采透析，得到空白脂质体溶液。
168.在另一优选例中，所述的透析在hepes缓冲液(8-12mm，ph为6.6-6.8)中进行。
169.在另一优选例中，所述的有机溶剂与所述水相的体积比为1:8-12。
170.在另一优选例中，所述步骤(iii)中，所述药物与所述空白脂质体的重量比(药脂比)为0.02-0.1，较佳为0.022-0.085，更佳地0.025-0.05，更佳地0.028-0.04，更佳地0.033-0.037。
171.在另一优选例中，所述步骤(iii)中，所述药物与所述空白脂质体的重量比(药脂比)为1:25-35，较佳为1:28-32。
172.组合物
173.本发明还提供一种组合物，所述的组合物包括本发明所述的纳米颗粒。
174.在本发明的一个优选例中，所述的组合物为药物组合物。
175.在本发明的一个优选例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
176.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
177.在另一优选例中，所述注射剂选自：注射液、混悬液、冻干粉针剂。
178.在另一优选例中，所述注射剂给药方式选自：静脉注射、皮下注射、原位注射。
179.用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
180.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
181.典型地，当以口服方式给予本发明的药物组合物时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。
182.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
183.在本发明的一个优选例中，所述药物组合物的剂型为口服制剂、注射制剂或外用制剂。
184.在本发明的一个优选例中，所述药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
185.在本发明的一个优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
186.在本发明的一个优选例中，所述注射剂选自：液体制剂、混悬液制剂、冻干粉针剂。
187.在本发明的一个优选例中，所述注射剂给药方式选自：静脉注射、皮下注射、原位注射。
188.肿瘤
189.本发明所述的肿瘤优选选自下组：乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌，或其组合。
190.在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括受体表达肿瘤。
191.在另一优选例中，所述受体包括her2。
192.在另一优选例中，所述的受体与所述的抗体结合。
193.在另一优选例中，所述结合包括特异性结合。
194.在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括her2高表达肿瘤。
195.在本发明的一个优选例中，所述的her2高表达指与正常细胞的her2表达a0相比，肿瘤细胞的her2表达a1，且a1/a0＞1.2，较佳地＞1.5。
196.在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括对抗肿瘤药物多药耐药性的肿瘤。
197.用途和方法
198.本发明还提供一种本发明所述的纳米颗粒或本发明所述的组合物的用途，用于制备药物，所述的药物用于预防和/或治疗肿瘤。
199.本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，，对所需对象施用本发明所述的纳米颗粒或本发明所述的组合物。
200.在本发明一个优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
201.本发明的主要优点包括：
202.本发明开发了一种表面含有抗体的纳米颗粒如脂质体，纳米颗粒如脂质体表面含有10-40个脂质体时能够更有效发挥对肿瘤治疗效果且改善肿瘤的多药耐药性，从而克服了普遍认为的脂质体表面的抗体越多，与靶细胞结合和效果越好的技术偏见，为进一步的临床开发打下了基础。
203.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
204.实施例
205.her2抗体的fab片段(aher2 fab)的重链氨基酸序列如seq id no.：1所示，其中重链第229位的半胱氨酸(c)含有一个游离巯基，与linker(dspe-peg-mal)连接；轻链氨基酸序列如seq id no.：2所示，
206.seq id no.：1(n端到c端)：
207.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcaa
208.seq id no.：2(n端到c端)：
209.diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgt
mal、dspe-mpeg2000与连接产物aher2-dspe的混合物，因此接着通过凝胶柱以及离子层析柱对其进行纯化，得到aher2-dspe单一胶束。
220.连接产物aher2-dspe通过非还原性sds-page以及rp-hplc进行鉴定。
221.图1a非还原性sds-page胶图检测结果显示her2 fab抗体与dspe-peg-mal摩尔比为1:1为较佳的反应比例；图1b结果表示，通过rp-hplc检测her2 fab抗体与dspe-peg-mal摩尔比为1:1时连接效率大于40％；图1c和图1d分别通过非还原性sds-page以及rp-hplc方法鉴定纯化后的aher2-dspe，纯度大于95％。
222.2.2.her2 fab抗体片段修饰的多柔比星脂质体(aher2-ldx)制备
223.为了精确的制备特定her2 fab个数的多柔比星素脂质体，提供了一种计算方式，具体如下：
224.按照一个脂质体表面连接了x个抗体分子计算：
225.已知参数：
226.(1)蛋白平均相对分子质量，记作mw；
227.(2)脂质量，记作y；
228.(3)脂质平均相对分子质量，记作l(需根据脂质比例计算得到)；
[0229][0230]
(4)平均每个脂质体含有n个脂质分子(需根据脂质体平均大小计算得到)；
[0231]
(5)摩尔常数na
[0232]
则脂质量为y，制备每个脂质体表面含有x个抗体需要投入抗体量p为：
[0233]
计算公式：
[0234]
aher2-dspe通过后插法锚定在多柔比星脂质体(ldx)表面制备获得her2fab抗体修饰的多柔比星脂质体(aher2-ldx)，具体操作方法如下：
[0235]
首先分别对制备的aher2-dspe的抗体浓度和多柔比星脂质体的脂质浓度分别进行检测；根据实验要求按照上述公式计算量取aher2-dspe和多柔比星脂质体的量，两者充分混合，60℃孵育30min，反应完成后恢复至室温后，再放入2～8℃条件保存。
[0236]
如图2a～图2c和表2分别列举了抗体个数为10、20、40的aher2-ldx平均粒径和pdi，三者平均粒径大小均在80～100nm左右，pdi均小于0.1，且平均粒径大小与脂质体表面连接抗体数量无关。
[0237]
表2
[0238]
样品名称粒径(nm)pdi10-c aher2-ldx89.92
±
1.090.03220-c aher2-ldx92.16
±
0.330.04640-c aher2-ldx95.90
±
0.550.093
[0239]
注：10-c aher2-ldx表示多柔比星脂质体表面连接了10个her2 fab抗体，依次类推。
[0240]
另外，本发明提供了一种检测aher2-dspe后插入脂质体中后插效率的方法，具体
操作如下：sepharose 4b填料装填8mm
×
105mm的凝胶柱；pbs缓冲液平衡柱子；量取120μl后插后的aher2-ldx脂质体上至凝胶柱上方，通过重力作用收集洗脱液；其中游离的aher2-dspe与aher2-ldx脂质体能够完全分离开，通过rp-hplc对aher2-dspe进行定量检测，游离的aher2-dspe量记为m
游离
，aher2-ldx脂质体上的aher2-dspe记为m
后插
，则后插效率为e
后插
＝m
后插
/(m
游离
+m
后插
)*100％。
[0241]
实验结果显示，aher2-dspe后插入ldx中的后插效率大于95％(如图3所示)，表明本发明提供的后插法制备抗体修饰载药脂质体的方法优良。
[0242]
3.不同肿瘤细胞株的her2表达情况
[0243]
采用流式细胞术检测sk-br-3、bt474、nci-n87、mda-mb-453、mcf-7、mda-mb-231、mgc-803、a2780细胞表面的her2抗原表达情况，结果如图4和表3所示。
[0244]
表3不同细胞表面her2表达水平
[0245][0246][0247]
备注：her2表达强度用+号表示，0/1+为低表达。2+为中表达，3+为高表达。rmfi表示相对平均荧光强度。
[0248]
由以上实验数据可以看出，sk-br-3、nci-n87、bt474为her2高表达细胞系；mda-mb-453为her2中表达细胞系；mcf-7、a2780、mgc-803和mda-mb-231为her2低表达/阴性细胞系。
[0249]
4.her2抗体修饰的免疫脂质体(aher2-ldx)处方筛选
[0250]
采用文献(optimization of drug combinations using feedback system control.nature protocols.2016；11:302-315.)中feedback system control(fsc)技术对aher2-ldx表面aher2 fab抗体个数0、10、20、40、80，ldx处方a、b、c、d，以及空白脂质体e，共10个参数进行组合，通过药物对her2高表达以及低表达细胞的杀伤毒性(ic
50
)进行评价。
[0251]
4.1.不同组合药物aher2-ldx制备
[0252]
上述的aher2-ldx制备过程，通过调整加入的aher2-dspe、以及多柔比星脂质体的含量制备表面her2 fab抗体个数分别为0、10、20、40、80，ldx处方a、b、c、d，以及空白脂质体e，10个参数两两组合共产生25个组合，具体如下：a-ldx、b-ldx、c-ldx、d-ldx、空白脂质体
e、10-d aher2-ldx、10-c aher2-ldx、10-b aher2-ldx、10-a aher2-ldx、20-d aher2-ldx、20-c aher2-ldx、20-b aher2-ldx、20-a aher2-ldx、40-d aher2-ldx、40-c aher2-ldx、40-b aher2-ldx、40-a aher2-ldx、80-d aher2-ldx、80-c aher2-ldx、80-b aher2-ldx、80-a aher2-ldx、10-e aher2-ldx、20-e aher2-ldx、40-e aher2-ldx、80-e aher2-ldx(注：-号前面数字表示her2 fab抗体个数，后面字母表示ldx不同处方，处方信息见上述表1)。
[0253]
4.2.细胞毒性实验评价aher2-ldx细胞毒性作用
[0254]
通过promega公司的luminescent cell viability assay发光法细胞活力检测试剂盒检测aher2-ldx对肿瘤细胞的杀伤毒性作用。具体操作步骤如下：提前一天采用胰酶消化不同肿瘤细胞，按照每孔5000～10000个细胞/100μl培养基的细胞密度将细胞接种于96孔透明底黑色板中；待细胞完全贴壁生长后，按照如下药物浓度梯度0、0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、150μg/ml加入，培养基总体积为100μl，每个浓度设置三个重复孔；37℃培养箱中培养24h，24h后去除含药培养基，加入新鲜的完全培养基继续培养48h；提前将缓冲液取出融化，并平衡至室温，冻干粉底物同时提前平衡至室温；将缓冲液吸取到底物中，摇晃或上下颠倒使溶液均一，底物在1min内完全溶解；将96孔细胞培养板从细胞培养箱中取出，并平衡至室温，平衡时间约半个小时；准备只含培养基不含细胞的对照孔，以得到背景发光值；向每孔中加入100μl的试剂；将96孔细胞板放置在水平振荡器上，混匀内容物2min，促进细胞裂解；将96孔细胞板室温静置10min，待荧光信号稳定；待荧光信号稳定后，采用tecan公司的spark 10m酶标仪记录发光信号值。
[0255]
采用graph prism 8.0分析软件对记录的发光信号值进行统计分析，计算各个药物组合的ic
50
值，结果见表4-1、表4-2和表4-3，图5a、图5b、图5c分别列举了10-c aher2-ldx、20-c aher2-ldx、10-b aher2-ldx、20-b aher2-ldx和处方a-ldx在her2高表达细胞系sk-br-3、nci-n87、bt474中抑制肿瘤细胞生长的情况。
[0256]
通过这些数据充分说明：her2 fab抗体自身对细胞毒性很小；药物脂质浓度比例降低可以提高细胞毒性作用；ldx表面修饰了her2 fab抗体片段可以进一步提高药物对细胞的药物毒性；综合上述结果抗体个数10～40是较优的组合区，进一步的10-c aher2-ldx这一药物组合表现出***优的结果。对her2高中低表达的细胞系进行研究，结果显示aher2-ldx对her2整个表达谱细胞均能很强地细胞杀伤毒性，具体如表4-4。
[0257]
表4-1
[0258]
[0259][0260]
表4-2
[0261][0262]
表4-3
[0263][0264]
表4-4
[0265]
[0266][0267]
5.考察不同抗体个数的免疫脂质体的结合活性
[0268]
在体外条件下，用gator非标记生物分析仪，采用不同her2抗原水平的探针，分析和观察不同抗体个数的免疫脂质体的结合活性，具体操作步骤如下：(1)将待分析样品及buffer缓冲液加入相应96孔板中，并将探针放置于对应的孔中；(2)设置板的温度为shaker当前温度，shaker b转速设置为1000rpm，使全新的探针在k buffer中预湿润3min；(3)检测程序设置：
①
baseline1：k buffer，120s；
②
loading：human her2/erbb2(23-450)protein,fc tag，240s；
③
baseline2：k buffer，120s；
④
association：待分析样品溶液，200s左右(结合曲线趋于平缓即可)；
⑤
disassociation：k buffer，200s左右(解离曲线趋于平缓即可)；
⑥
重生：re buffer，5s，q buffer，5s，一组为一个循环，共循环三次。
[0269]
采用gator分析软件对结合-解离曲线进行拟合分析，结果如图6所示，从图6中可以看出，结合的脂质体数量随着抗原水平的提高而增加，但结合的动力学与脂质浓度和抗原水平并无太大关系。增加脂质体表面抗体的个数，能够加快结合的快慢，但是对***终的结合能力并没有太大关系。
[0270]
6.考察偶联不同her2抗体的fab片段数量的aher2-lip与肿瘤细胞的结合能力
[0271]
制备了dii荧光染料标记的脂质体(记作：dii-lip)，表面分别修饰了3、6、13、25、50、100、200个aher2 fab抗体片段(记作：aher2-dii-lip)，应用流式细胞术，分别分析与her2高表达细胞系sk-br-3以及her2低表达/阴性细胞系mda-mb-231的结合情况。
[0272]
制备好的aher2-dii-lip脂质浓度分别调整为0.5mg/ml，分别取10μl样品与2.5
×
105个sk-br-3细胞以及2.5
×
105个mda-mb-231细胞混合，4℃避光孵育30min；孵育好后，1ml pbs缓冲液清洗2～3遍，***后使用200μl pbs缓冲液重悬细胞；流式细胞仪上机检测。
[0273]
结果如图7a与图7b所示，结果显示当脂质体表面aher2 fab个数仅3个时aher2-dii-lip与sk-br-3细胞即有明显的结合活性，当aher2 fab个数达到13～25个左右时
aher2-dii-lip与sk-br-3细胞结合的荧光强度趋于饱和状态；aher2-dii-lip表面抗体个数低于100个时与低表达/阴性细胞系mda-mb-231基本无结合活性，而抗体个数大于100个时有结合但结合强度很弱。
[0274]
7.考察aher2-ldx的细胞细摄取
[0275]
将aher2 fab抗体片段偶联多柔比星脂质体加入her2高表达细胞系bt474中，检测细胞内的多柔比星药物含量。
[0276]
提前一天胰酶消化bt474细胞，按照5
×
105个细胞/孔铺于6孔板中；c-ldx和10-c aher2-ldx分别按照多柔比星的量加入10μg、50μg两个剂量，并设置空白对照孔；药物加入后，4℃孵育4h；之后pbs缓冲液轻轻润洗2～3遍，细胞刮板将细胞刮下，离心去除上清；-80℃反复冻融3次破碎细胞；加入100μl乙腈/甲醇(v/v,1:1)，沉淀蛋白；10000rpm离心10min，取上清，并采用0.22μm有机过滤膜过滤；hplc检测多柔比星含量。
[0277]
从图8中可以看出只有her2 fab抗体片段偶联的多柔比星脂质体才能够有效地将药物输送到细胞内，说明aher2-ldx能够特异性地靶向her2表达的肿瘤细胞并介导内吞作用。
[0278]
8.考察aher2-ldx对肿瘤化药耐药性治疗
[0279]
将her2抗体偶联的多柔比星脂质体加入多柔比星耐药细胞，显示其能够逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药作用。
[0280]
为了考察her2 fab抗体靶向的多柔比星脂质体在多柔比星耐药肿瘤细胞株中的性能，选用mcf-7/adr多柔比星乳腺癌耐药株进行测试。采用promega公司的luminescent cell viability assay发光法细胞活力检测试剂盒，检测her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体对肿瘤细胞的杀伤作用，设置trastuzumab单抗作为对照，同时比较非靶向的处方c和处方a多柔比星脂质体。应用graph prism 8.0分析软件，拟合细胞杀伤毒性曲线，计算各个ic
50
值，结果见图9。
[0281]
细胞毒性结果显示her2 fab抗体靶向的多柔比星脂质体、处方c和处方a多柔比星脂质体、以及trastuzumab单抗在mcf-7/adr中的ic
50
值分别为13.70μg/ml、46.41μg/ml、101.30μg/ml，表明her2 fab抗体靶向的多柔比星脂质体对多柔比星耐药细胞株仍具有很强的细胞毒性作用。因而，在临床上具有潜在的治疗多柔比星耐药肿瘤患者的药效。
[0282]
9.考察偶联不同her2 fab抗体数量的aher2-ldx动物体内药效情况
[0283]
9.1.bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建
[0284]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建：购买4～5周龄、体重18g左右、spf级的雌性balb/c-nude裸鼠，于动物饲养间适应性饲养一周左右；bt474细胞生长至指数增长期，采用胰酶消化细胞，离心收集细胞，pbs缓冲液清洗2～3次，pbs缓冲液重悬细胞并计数，调节细胞密度为1*10^8个细胞/ml；提前从-20℃冰箱中拿出基质胶matrigel冰上融化，细胞悬液与基质胶matrigel按照1:1等体积混合；按照5*106～1*107个细胞量，1ml注射器吸取对应体积的细胞悬液，皮下接种于裸鼠右侧腋下部位，接种后按压针孔部位30s，防止细胞液漏出。接种后皮下可见一明显皮丘。定期观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长。
[0285]
9.2.给药及药效评价
[0286]
待肿瘤大小长至100～200mm3时，将小鼠随机进行分成六组，每组至少6只，六组分
别为：对照组、处方a多柔比星脂质体组、处方c多柔比星脂质体组、以及抗体数量分别为10、20、40的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体组(即10-c aher2-ldx组、20-c aher2-ldx组、40-c aher2-ldx组)。
[0287]
分组后对照组尾静脉给予空白脂质体，处方a多柔比星脂质体组根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的处方a多柔比星脂质体药物剂量；处方c多柔比星脂质体组同样根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的处方c多柔比星脂质体药物剂量；10-c aher2-ldx组、20-c aher2-ldx组、40-c aher2-ldx组分别根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体药物剂量。每周给药一次，共给药5次；隔天记录小鼠小鼠体重以及肿瘤生长曲线；给药结束后将小鼠安乐死处理(对照组由于肿瘤体积过大，第18天安乐死)。
[0288]
主要是检测受试药物对乳腺癌bt474小鼠移植瘤的生长抑制作用或完全治愈能力。
[0289]
肿瘤体积和荷瘤鼠体重测量：使用游标卡尺隔天测量，肿瘤体积计算公式为v＝0.5a
×
b2，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径。
[0290]
肿瘤生长抑制率tgi(％)＝[1-(d
i-d0)/(c
i-c0)]
×
100，其中d
i-d0》0。d0为给药组(drug)***给药时的平均肿瘤体积，di为给药组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积；c0为对照组(control)***给药时的平均肿瘤体积，ci为对照组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积。
[0291]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤体内药效结果如图10所示。结果显示，处方a多柔比星脂质体、处方c多柔比星脂质体、以及10-c aher2-ldx、20-c aher2-ldx、40-c aher2-ldx在给药后第18天抑制肿瘤生长率(tgi％)分别为50.55％、60.12％、69.66％、61.98％、62.94％，表明her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体相较于处方c多柔比星脂质体以及处方a多柔比星脂质体的具有更强的抑制肿瘤生长能力，但多柔比星脂质体表面抗体数量增加并未能进一步提高提高抑制肿瘤作用，此结果与细胞杀伤实验结果一致。此实验结果充分说明：1)脂质比例降低的多柔比星脂质体不仅在体外对肿瘤细胞具有更强的杀伤作用，在体内对肿瘤生长也具有更佳的抑制肿瘤生长效果；2)进一步地，her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体更进一步提高抑制肿瘤生长能力，表明多柔比星脂质体表面修饰抗体可发挥靶向作用提高抑制肿瘤效果。
[0292]
10.考察aher2-ldx动物体内剂量依赖药效情况
[0293]
10.1.nci-n87乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建
[0294]
选用细胞表面her2高表达的nci-n87胃癌细胞株构建balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型。
[0295]
购买4～5周龄、体重18g左右、spf级的雌性balb/c-nude裸鼠，于动物饲养间适应性饲养一周左右；nci-n87细胞生长至指数增长期，采用胰酶消化细胞，离心收集细胞，pbs缓冲液清洗2～3次，pbs缓冲液重悬细胞并计数，调节细胞密度为2*10^8个细胞/ml；提前从-20℃冰箱中拿出基质胶matrigel冰上融化，细胞悬液与基质胶matrigel按照1:1等体积混合；按照1*10^7个细胞量，1ml注射器吸取对应体积的细胞悬液，皮下接种于裸鼠右侧腋下部位，接种后按压针孔部位30s，防止细胞液漏出。接种后皮下可见一明显皮丘。定期观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长。
[0296]
10.2.给药及药效评价
[0297]
待肿瘤大小长至100～200mm3时，将小鼠随机进行分成七组，每组至少6只，七组分别为：对照组、trastuzumab单抗组、处方a多柔比星脂质体组和剂量分别为0.5、2、5、10mg/kg的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体(10-caher2-ldx)组。
[0298]
分组后对照组尾静脉给予空白脂质体，处方a多柔比星脂质体组根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的0.17药脂比多柔比星脂质体药物剂量，10-caher2-ldx组同样根据裸鼠体重尾静脉分别给予0.5、2、5、10mg/kg的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体药物剂量，同时设置trastuzumab单抗为对照，给予5mg/kg，每周给药一次，共给药5次；隔天记录小鼠体重以及肿瘤生长曲线；给药结束后将小鼠安乐死处理。
[0299]
主要是检测受试药物对胃癌nci-n87小鼠移植瘤的生长抑制作用或完全治愈能力。
[0300]
(1)肿瘤体积测量：使用游标卡尺隔天测量，肿瘤体积计算公式为v＝0.5a
×
b2，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径。
[0301]
(2)肿瘤生长抑制率tgi(％)＝[1-(d
i-d0)/(c
i-c0)]
×
100，其中d
i-d0》0。d0为给药组(drug)***给药时的平均肿瘤体积，di为给药组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积；c0为对照组(control)***给药时的平均肿瘤体积，ci为对照组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积。
[0302]
nci-n87胃癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤体内药效结果如图11所示，处方a多柔比星脂质体、trastuzumab单抗以及剂量分别为0.5、2、5、10mg/kg的10-caher2-ldx的肿瘤抑制率分别为：77.27％、14.49％、28.41％、81.71％、88.75％、96.33％，此结果表明偶联10个her2 fab抗体的多柔比星脂质体在体内对her2高表达的nci-n87胃癌肿瘤模型生长具有更佳的抑制肿瘤生长效果，且具有剂量依赖关系。
[0303]
11.考察aher2-ldx对her2低表达肿瘤模型动物体内药效情况
[0304]
11.1.mcf-7乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建
[0305]
选用细胞表面her2低表达的mcf-7乳腺癌细胞株构建balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型。
[0306]
肿瘤模型构建方法同10.1.nci-n87乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建。
[0307]
11.2.给药及药效评价
[0308]
待肿瘤大小长至100～200mm3时，将小鼠随机进行分成六组，每组至少6只，六组分别为：对照组、trastuzumab单抗组、处方a多柔比星脂质体组和剂量分别为2、5、10mg/kg的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体(10-caher2-ldx)组。
[0309]
分组后对照组尾静脉给予空白脂质体，处方a多柔比星脂质体组根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的0.17药脂比多柔比星脂质体药物剂量，10-caher2-ldx组同样根据裸鼠体重尾静脉分别给予2、5、10mg/kg的her2 fab抗体靶向处方c多柔比星脂质体药物剂量，同时设置trastuzumab单抗为对照，给予5mg/kg，每周给药一次，共给药5次；隔天记录小鼠体重以及肿瘤生长曲线；给药结束后将小鼠安乐死处理。
[0310]
主要是检测受试药物对乳腺癌癌mcf-7小鼠移植瘤的生长抑制作用或完全治愈能力。
[0311]
药效评价方法同10.2.所述。
[0312]
mcf-7乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤体内药效结果如图12所示，trastuzumab单抗、处方a多柔比星脂质体以及剂量分别为2、5、10mg/kg的10-caher2-ldx的肿瘤抑制率分别为：2.91％、62.16％、69.67％、92.18％、97.38％，此结果同样表明偶联10个her2 fab抗体的多柔比星脂质体在体内对her2低表达的mcf-7乳腺癌肿瘤模型生长具有更佳的抑制肿瘤生长效果，且具有剂量依赖关系。由结果推论：her2 fab抗体修饰的多柔比星脂质体对her2低表达的肿瘤患者具有与her2高表达患者同样的治疗效果，具有潜在的延伸适应症范围。
[0313]
12.考察aher2-ldx动物体内药代动力学特性
[0314]
通过荷瘤小鼠模型中研究了不同抗体数量的多柔比星脂质体的体内药代动力学特征。
[0315]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建方法见实施例9.1.所述，待皮下肿瘤体积长至400～600mm3时进行分组及给药。
[0316]
给药：***组按照小鼠体重尾静脉给予10-c aher2-ldx，药物剂量为5mg/kg；第二组按照小鼠体重尾静脉给予10-c aher2-ldx，药物剂量为5mg/kg。采血：分别于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72小时采血，收集在edta抗凝管中，冰上放置，4摄氏度，3000rpm转速离心30min，小心吸取上层血浆至新的贴有标签的离心管中，并进行后续检测或者-80摄氏度冰箱保存。
[0317]
血浆中多柔比星药物含量检测：准确量取40μl血浆样品于离心管中；按照血浆与有机试剂1:4的比例加入160μl乙腈-甲醇(1:1，v/v)，涡旋震荡1～2min，充分使血浆中的蛋白沉淀，1000
×
g转速4摄氏度离心10min；小心吸取上清至新的离心管中，注意此步骤一定要避免吸入蛋白层，在1000
×
g转速4摄氏度离心10min；0.22μm有机滤头过滤；取50ul于上样瓶中，hplc检测。高效液相色谱色谱条件(参照中国药典)：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的athena c18柱(4.6
×
150mm，5μm)；以十二烷基硫酸钠溶液(取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml，加水500ml使溶解)-乙腈-甲醇(500：500：60)为流动相；检测波长为254nm；检测流速为1.0ml/min；上样体积为10μl。
[0318]
血浆中her2 fab抗体含量检测：采用elisa法检测血浆中her2 fab抗体的含量，her2抗原4摄氏度提前一天包被在96孔酶标板中；每孔加入350μl清洗液，洗3次；每孔加入300μl封闭液，37摄氏度1h；每孔加入350μl清洗液，洗3次；标准品、样品或者对照品加入相应孔中，100μl/孔；用封板胶纸封住反应孔；37摄氏度震荡孵育1h；每孔加入350μl清洗液，洗3次；加入显色底物100μl/孔，避光孵育室温3-15min；加入终止液100μl/孔，混匀后立即检测od450值。
[0319]
分析：不同her2 fab抗体数量的多柔比星脂质体在bt474荷瘤小鼠中的血药浓度结果如图13a所示，血液样品中her2 fab抗体浓度变化如图13b所示。血液中药物浓度与her2 fab抗体变化可以用来提示药物从her2 fab抗体靶向脂质体中释放的过程，可以看到不同抗体密度的脂质体，体内的释放过程不同。低抗体密度脂质体的药物释放较慢，而her2 fab释放较快。
[0320]
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