1.本发明涉及到一种水不溶性药物脂质体组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脂质体是一种具有脂质双分子层的囊泡，可以用于定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为微米或纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构的双分子层微小囊泡，具有良好的生物相容性。
3.人体血液内的微粒和外来物，会被人体的血管过滤器官，如胰脏、肺和肝逐渐从循环系统中清除，一般而言血液中的颗粒物包括红细胞(直径约为8μm)、白细胞(直径约为6-8μm)和血小板(直径约为1-3μm)。在大多数器官和组织的微循环中能允许这些血细胞自由通过。当尺寸大于10-15μm的小血(血凝块)存在于循环内时，会出现毛细管梗塞或阻塞的危险，导致局部缺血或缺氧和可能，导致组织死亡。因此，必须避免在循环内注入直径大于10-15μm的颗粒。但是，直径小于7-8μm的颗粒混悬液是比较安全的，可用于输送以脂质体和乳剂、营养剂及造影剂等形式出现的药理活性物质。
4.人体内颗粒的大小和他们的输送方式决定了他们的生物学行为。尺寸范围在几纳米(nm)到100nm的颗粒在人体内的行为：间隙注射后进入淋巴毛细管，并在淋巴结内可能产生吞噬作用；在静脉内/动脉内注射后，直径小于2μm的颗粒：很快会被网状内皮系统(res)(也称单核吞噬细胞系统(mps))从血液中清除；直径大于7μm的颗粒：在静注后会被肺毛细管截留，在动脉内注射后，这些颗粒会被到达的***个毛细管床截留，吸入的颗粒被肺泡的巨噬细胞捕获。
5.同样，对于脂质体而言之所以可以成为靶向给药系统，一方面，表面未经修饰的脂质体进入人体后，通常易被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾等组织器官中积蓄，粒径在纳米范围的脂质体由于肿瘤存在的高通透性和滞留效应(即epr效应)能够有效蓄积于肿瘤部位，上述性质可称为脂质体的被动靶向；另一方面，脂质体表面可经过专门的共价或非共价修饰特殊配体，配体包括抗体、多肽、核酸适配体、糖基及小分子等，通过配体-受体相互作用介导脂质体被特定靶细胞高效摄取，这被称为主动靶向，常被比喻为“生物导弹”。脂质体的靶向递药能力能够提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体的载药方式可以分为被动载药和主动载药两种方式，一般而言对于疏水性药物采用被动靶向的技术，而水溶性药物多采用主动靶向的技术。
6.脂质体的靶向、低毒、高效等优点，越来越被人们所认识，脂质体药物的释放受到多种因素的影响，包括粒度、脂膜组成、内水相以及载药方式等，对于一般的被动载药的脂质体而言，影响释药的主要受粒径和包封率的影响。
7.由于脂质体的材料(容易氧化、水解)或工艺(同时脂质体制备工艺中选用毒性有机溶媒，工艺去除不完全)或成分组成(不同材料的组合)的原因引起的脂质体的稳定性、低包封率、渗漏等问题，导致贮存期间易发生聚集、融合及药物渗透、溶媒的注射毒性、药剂量
倾泻(dose dumping)，靶向效果不佳等医疗事故，因此为了解决上问题，目前主要集中在对制备方法如空冷冻干燥、喷雾干燥等工艺改进，同时也通过改性成膜材料增加韧性、或者是加入一定的赋形剂保护剂以提高稳定性和包封率、控制粒径，如采用冷冻干燥法将脂质体制成冻干粉针剂，不仅能大大延长其在体外的保存时间，同时也能避免药物产生变性，使药物中易氧化的物质得到保护，且微生物几乎无法进行，从而提高脂质体的物理和化学稳定性。
8.cn200610028725.7a中公开了一种稳定的脂质体组合物，由饱和磷脂和胆固醇作为成膜脂质，加入维生素e作为抗氧剂，以蔗糖作为冻干赋形剂，采用薄膜蒸发-冷冻干燥的方法制备，这种脂质体可作为抗癌药物紫杉醇的载体。
9.cn201310376983.4公开了一种注射用多西他赛纳米粒及其制备方法，采用冷冻干燥法制备，降低有机溶剂的残留。
10.在脂质体中添加热敏性辅料制成热敏性脂质体、添加ph敏感物质制成ph敏感脂质体、添加阳离子或阴离子制成阳离子脂质体或阴离子脂质体或添加表面活性剂等。
11.但是，上述方法仍存在以下问题，冻干周期长，影响产能，所需的投入成本高，加入的稳定剂对制备工艺要求高，毒性有机溶剂的影响，因为难以精确控制制品温度，造成批与批之间、批内间产品质量不均一，进而还影响产品外观色泽、形状和包封率等，生产过程中废品率高，同时特殊的材料的脂质体在材料安全性和制造工艺上还存在诸多问题。
12.同时，由于不同类型药物的理化性质差异，如结构、溶解性、稳定性等，其均有相应的制备技术要求，同时在技术、膜材料、中试放大等环节需要不断完善，因此不同的药物所采用的的脂质体材料和工艺相差较大，很难形成一个适用多数药物的方法。因此需要通过建立相应的质量标准来评价不同制备工艺和不同原理的脂质体，目前对于脂质体的质量评价，主要有8项指标，脂质体的形态和粒径(含分散性)，包封率，载药量，突释和渗漏率，体外释放度，磷脂氧化程度，有机溶剂残留和体内外功能评价。但总体来说，现在脂质体仍然存在靶向性有待进一步提高，包封率低、稳定性差、制备工艺复杂等缺点。
13.因此，研究一种高效、安全、稳定、靶向性强、均一性好、粒径分布均匀、质量稳定和可靠、制备工艺简便的脂质体一直是脂质体研究的重点和方向。
14.药用辅料环糊精有一个中空的疏水立体手性内腔，其“内疏水，外亲水”的结构特性能包封多种空间尺寸适合的有机小分子(底物)，形成非共价主-客体复合物(包合物)，其***显著的药学作用便是增加难溶药的水溶性和增加药物的稳定性，目前将环糊精及其衍生物用于紫杉醇和白消安主要如下，cn100486645c，通过将紫杉醇于环糊精和药用辅料制备成组合物，但是组成的组合物在临床使用浓度下稳定时间较长为新的环糊精衍生物，其安全性未得到临床验证，存在安全隐患。us2018318249a1/cn201880044721.9和cn201810888451.1采用环糊精及其衍生物增溶白消安取得了一定效果，但是并没有改变药效和药动学，在临床上与白消安注射液基本相当，提高了耐受性，但是都使用了大量的丙酮以及大量使用环糊精，导致工艺过程较为复杂，可重复性较差。
15.紫杉醇和白消安均为水不溶药物，一般采用被动靶向脂质体即可解决，但目前的市售紫杉醇脂质体和白消安脂质体的相关研究均显示还存在问题，因此还有改进提高的空间。
16.紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验
证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上***热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间***有效的抗癌药物之一。但紫杉醇难溶于水(水中的溶解度仅为0.006mg/ml)，但是可以使用有机溶剂溶解，如，乙醇、甲醇、氯仿、dma、石油醚等有机溶剂，***早的紫杉醇采用聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇增溶，市售紫杉醇注射液于1992年由美国fda批准上市，因聚氧乙基代蓖麻油在体内会促进组织胺释放，使人体产生过敏反应，中等程度过敏反应的发生率高达50％，甚至危及生命，并能加重紫杉醇的外周神经毒性、产生肝脏毒性、影响抗肿瘤效果等毒副反应，限制了传统紫杉醇注射液的临床应用。
17.注射用紫杉醇脂质体于2003年在中国上市，采用卵磷脂、胆固醇、苏氨酸、葡萄糖为辅料，临床使用需要专用的振荡器振摇5min，在临床使用过程中***常见的问题在配液过程，只能用5％葡萄糖注射液溶解和稀释，不可用生理盐水或其他溶液溶解、稀释，同时为避免免发生脂质体聚集，采用振荡器振荡进行溶液重组，临床使用极不方便，造成医疗资料浪费，以上几点均说明现有的紫杉醇脂质体产品还存在配伍问题，纠其原因主要还是脂质体辅料系统以及制备工艺导致产品再重组后的不稳定，主要表现分散不均匀、聚集、析出沉淀。
18.白消安是一种双甲基磺酸酯类的双功能团烷基化剂，***早发现于1953年。白消安主要适用于血液及骨髓方面的增殖性疾病，特别对于慢性粒细胞白血病、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化症等疾病具有较好的疗效。但由于白消安的溶解性差，尤以水溶性***差，口服后难以吸收，且口服给药所需剂量高，同时药物吸收个体差异大，导致用量难以准确控制，因此，上市销售的白消安产品仍以注射剂为主，目前已经上市的白消安注射液采用dma/peg增溶，因dma的神经毒性、肝脏毒性、生殖毒性而限制了其广泛使用。
19.ep1089727 b1采用脂质体技术包埋白消安体，us7351427b2脂质体中增加谷胱甘肽(gsh)或合成(gsh)前体的化合物，用于降低白消安脂质体的血液学毒性，但是仍然采用氯仿、二氯甲烷等助溶剂，残留较高，引发血液学毒性，而且形成的脂质体粒径分布范围广50-300nm之间，影响体内的分布。
20.目前将脂质体技术与环糊精增溶技术联合用于药物的研究，相关研究还较少，us20090196918a1使用在金属离子存在下疏水性内酯药物的脂质体研究，cn102596178b，使用磺丁基醚环糊精作为内水相的脂质体研究，属于主动靶向脂质体的类型。虽然这些研究形成的产品仍然是脂质体，但是在对某些指标产生了根本的改变，如，脂质体质量更稳定，包封率提高，批件批内稳定性提高，粒径分布范围更小，体内的靶向效果提高等。
21.目前还未发现同时使用脂质体技术和环糊精技术用于研究紫杉醇和白消安研究。
22.因此，针对现有的脂质体和环糊精技术的特点和不足，本发明人将被动靶向脂质体技术与环糊精包裹技术联用使用并用于水不溶药物紫杉醇和白消安，制成的脂质体粒径均一单室脂质体，平均粒径为10-100nm，并且在细胞水平上对肿瘤细胞的活性有显著提高，达到了减毒增效的效果。


技术实现要素：

23.本发明提供了一种粒径均一、粒径小、药效好的抗肿瘤药物脂质体的药物组合及
其制备方法。
24.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
25.本发明具体提供了一种水不溶药物脂质体的药物组合，包括水不溶药物、磷脂、胆固醇、磺丁基倍他环糊精的组合，其中水不溶药物：磷脂的重量比为1:1.0～10.0，水不溶药物：胆固醇的重量比为1:0.1～5，水不溶药物：磺丁基倍他环糊精的重量比为1:0.5～100。
26.作为本发明的一种优选，水不溶药物、磷脂、胆固醇、磺丁基倍他环糊精的重量比为1:1.0～10.0:0.1～5:0.5～100，优选为：1:1.0～5.0:0.1～1.0:1～50，更优选为：1:1.0～3.0:0.1～0.5:2～10，其中水不溶药物为紫杉醇或白消安。
27.本发明还提供了一种水不溶药物脂质体的制备方法，其特征在于，将处方量的水不溶药物、磷脂、胆固醇、sbecd、水、有机溶剂置于高压微射流设备中，于4-40℃，1-200mpa，循环5-30min，得均一溶液，25-40℃除去除用机溶剂，过滤，补加注射用水至处方量，分装西林瓶中，放置冷冻干燥机中，0.5～2h内迅速降温至-50℃并保持4～6h使冻结，一次干燥温度-30℃，24～48h，真空度5～15pa，解析干燥温度30℃，6～8h，真空度15pa，通入氮气或不通，得水不溶药物脂质体，其中所述的有机溶剂为乙醇或丙酮，水不溶药物为紫杉醇或白消安。
28.本发明还提供了一种水不溶药物脂质体的制备方法，还可以是，将处方量的水不溶药物、磷脂、胆固醇、sbecd、水、有机溶剂置于高压微射流设备中，于4-40℃，1-200mpa，循环5-30min，得均一溶液，过滤，分装西林瓶中，放置冷冻干燥机中，0.5～2h内迅速降温至-50℃并保持4～6h使冻结，一次干燥温度-30℃，24～48h，真空度5～15pa，解析干燥温度30℃，6～8h，真空度15pa，通入氮气或不通，得水不溶药物脂质体，其中所述的有机溶剂为乙醇或丙酮，水不溶药物为紫杉醇或白消安。
29.本发明制得的脂质体，包封率≥95％，平均粒径20～100nm
30.所述的脂质体采用注射用水、5％葡萄糖注射液、0.9％氯化钠注射液重组后至临床使用浓度使用，其稳定时间更长。
31.所述的脂质体可以用于乳腺癌、肺癌、血液瘤等疾病的治疗。
32.有益效果：
33.本发明采用生物相容性好的普通磷脂与胆固醇形成脂质体，脂质体中央为sbecd和药物分子，形成的脂质体具有包封率高、粒径小且分布均匀、稳定性好的特点。与传统的脂质体相比，主要的优势在于因粒径均一被动靶向的效果更明显更利于浓集于肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤的治疗效果，同时因不同于修饰磷脂限于安全性问题因此具有更好的生物相容性。
34.具体而言，本发明所述的脂质体，其特征在于利于脂质体材料可以形成脂质体，利于sbecd对某些药物分子的分散与增溶作用降低了有机溶剂的使用量，从而脂质体的有机溶剂残留降低，提高了用药安全性，同时本发明人在实验中意外发现sbecd可以抑制脂质体成分之间的相互聚集，不同的sbecd量，对脂质体的粒径大小有重要的影响。
具体实施例
35.下面所述实施例的目的是为了更好地说明本发明，但不应对本发明的范围构成限定。
36.实施例1：制备紫杉醇脂质体
37.按以下处方制备紫杉醇脂质体，将处方量的紫杉醇、磷脂、胆固醇、sbecd、水、有机溶剂置于高压微射流设备中，于4-40℃，1-100mpa，循环5-30min，得均一溶液，25-40℃除去除用机溶剂，过滤，补加注射用水至处方量，分装西林瓶中，放置冷冻干燥机中，0.5～2h内迅速降温至-50℃并保持4～6h使冻结，一次干燥温度-30℃，24～48h，真空度5～15pa，解析干燥温度30℃，6～8h，真空度15pa，通入氮气或不通，得紫杉醇脂质体。
38.表1紫杉醇脂质体处方
[0039][0040]
将上述紫杉醇脂质体进行包封率和粒径分布测定，结果如下：
[0041]
表2紫杉醇脂质体平均粒径和包封率结果
[0042]
处方平均粒径(nm)包封率(％)处方133.998.5处方234.498.2处方338.498.0处方442.095.2处方520.299.6处方640.198.4
[0043]
处方1和处方2进行放置于25℃
±
2℃，60％rh
±
10％rh条件下，测定6个月，主要测定指标含量、杂质、粒径、其结果如下，
[0044]
紫杉醇脂质体包封率测定方法：
[0045]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:水(3:1)为流动相，检测波长为227nm。理论板数按紫杉醇峰计算，应不低于1000。
[0046]
供试品溶液的制备：取本品1瓶，加5％葡萄糖注射液7.5ml,旋涡混匀10分钟,使成每1ml中含紫杉醇约为4mg的乳浊液。
[0047]
测定法：取用水充分溶胀后的葡聚糖凝胶(sephadexg-50，100-300μ)加入内径为0.7cm的层析柱中,使凝胶层高约为21cm，用水100ml分次加入柱中，使柱平衡，精密吸取供试品溶液0.2ml,沿管壁加至凝胶层面上，用少量水冲洗层析柱壁，每次1ml，共两次，使样品进入凝胶柱，然后用细玻璃棒轻轻搅匀样品层(约1cm高)。用水洗脱，自洗脱液出现轻微浑
浊，即开始定量收集洗脱液15ml，摇匀，精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为测定被包封的紫杉醇含量me的溶液。凝胶柱再用不同浓度的乙醇梯度洗脱(沿管壁缓缓依次加入33％乙醇3ml，66％乙醇3ml及无水乙醇)，弃去洗脱液10ml，立即开始定量收集游离紫杉醇部分，共收集5ml，作为测定mf的溶液。照含量测定项下的色谱方法，取me和mf溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积按下式计算包封率：
[0048][0049]
式中：me为被包封在脂质体中的紫杉醇的峰面积
[0050]
mf为未被包封的游离紫杉醇的峰面积。
[0051]
含量以及杂质测定方法：同《中国药典》紫杉醇注射液方法
[0052]
粒径以及粒径分布测定方法：取成品脂质体适量，用注射用水稀释约含紫杉醇为：0.5mg/ml，置于百特t-90纳米粒径中，记录粒径以及粒径分布。
[0053]
表3稳定性结果
[0054][0055][0056]
实施例2
[0057]
白消安脂质体制备
[0058]
按以下处方制备白消安脂质体，将处方量的白消安、磷脂、胆固醇、sbecd、水、丙酮置于高压微射流设备中，于4-40℃，1-100mpa，循环5-30min，得均一溶液，30℃以下除去除用机溶剂，过滤，补加注射用水至处方量，分装西林瓶中，放置冷冻干燥机中，0.5～2h内迅速降温至-50℃并保持4～6h使冻结，一次干燥温度-30℃，24～48h，真空度5～15pa，解析干燥温度30℃，6～8h，真空度15pa，通入氮气或不通，得白消安脂质体。
[0059]
表4白消安脂质体处方
[0060][0061]
将上述白消安脂质体进行包封率和粒径分布测定，结果如下：
[0062]
表5白消安脂质体平均粒径和包封率结果
[0063][0064][0065]
白消安脂质体包封率测定：
[0066]
色谱条件：色谱柱zorbax sb c8，250
×
4.6mm，5μm，以乙腈：三氟乙酸：水(65:0.1：35)为流动相，检测波长为271nm，柱温40℃，进样量50μl，流速1.0ml/min。
[0067]
供试品溶液的制备：取本品1瓶，加5％葡萄糖注射液7.5ml,旋涡混匀10分钟,使成每1ml中含白消安约为4mg的乳浊液。
[0068]
测定法：取用水充分溶胀后的葡聚糖凝胶(sephadexg-50，100-300μ)加入内径为0.7cm的层析柱中,使凝胶层高约为21cm，用水100ml分次加入柱中，使柱平衡，精密吸取供试品溶液0.2ml,沿管壁加至凝胶层面上，用少量水冲洗层析柱壁，每次1ml，共两次，使样品进入凝胶柱，然后用细玻璃棒轻轻搅匀样品层(约1cm高)。用水洗脱，自洗脱液出现轻微浑浊，即开始定量收集洗脱液15ml，摇匀，精密量取2ml置10ml量瓶中，加丙酮醇稀释至刻度，摇匀，即为测定被包封的白消安含量m1的溶液。凝胶柱再用不同浓度的丙酮梯度洗脱(沿管壁缓缓依次加入33％丙酮3ml，66％丙酮3ml及丙酮)，弃去洗脱液10ml，立即开始定量收集游离白消安部分，共收集5ml，为m2的溶液，将m1和m2溶液分别进入适量的乙基二硫代氨基甲酸钠进行衍生。照含量测定项下的色谱方法，取衍生后的m1和m2溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积按下式计算包封率：
[0069][0070]
式中：m1为被包封在脂质体中的白消安的峰面积
[0071]
m2为未被包封的游离白消安的峰面积。
[0072]
粒径以及粒径分布测定方法：取成品脂质体适量，用注射用水稀释约含白消安为：0.5mg/ml，置于百特t-90纳米粒径中，记录粒径以及粒径分布。
[0073]
实施例3
[0074]
处方2和处方7样品重组后的稳定性测试，将实施例处方2和处方7样品用5％葡萄糖注射液重组稀释至0.5mg/ml，测定样品的粒径，结果如见表6，所选用溶剂还可以是0.9％氯化钠注射液或注射用水。
[0075]
表6
[0076][0077]
结果显示：使用使用sbecd使用脂质体在体外的稳定时间更长，在24h内均成均匀混悬状态，未出现沉淀或聚集的现象。
[0078]
实施例4
[0079]
将处方2和体外药效学体外抗肿瘤活性研究。
[0080]
用mtt法测定配制的紫杉醇脂质体以及紫杉醇注射液对于人乳腺癌细胞(mcf-7，mda-mb-435，mda-mb-435s)，人肺腺癌细胞(a549)，人小细胞肺癌(nci-h446)和人非小细胞肺癌(nci-h460)，人卵巢癌细胞(ho-8910，bcap-37)的抑制效果。
[0081]
试验设计：
[0082]
紫杉醇脂质体用以pbs溶解，并稀释至以下浓度，200μg/ml，20μg/ml，2μg/ml，0.2μg/ml，0.02μg/ml，0.002μg/ml，0.0002μg/ml，现配现用；阳性对照品紫杉醇注射液稀释至以下浓度，200μg/ml，20μg/ml，2μg/ml，0.2μg/mll，0.02μg/ml，0.002μg/ml，0.0002μg/ml，现配现用。
[0083]
取对数生长期的各细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10％新生牛血清dmem培养基稀释为5
×
104个细胞/ml，以100μl每孔接种于96孔培养板，5％co2，37℃培养箱内培养24小时。弃除含血清dmem每孔加90μl无血清dmem，以及10μl对应浓度的紫杉醇脂质体溶液，空白对照组加等量pbs，每组设6个复孔。
[0084]
检测方法和频率：给药后继续在5％co2，37℃培养箱内培养72小时，每孔加入10μl mtt(5mg/ml)，温育4小时，弃去培养基，每孔加入100μl的dmso，振荡10min，在酶标仪上以570nm波长测定每孔吸光度值，按下式计算肿瘤细胞抑制率:
[0085]
细胞抑制率(％)＝(对照组od值-药物组od值)/对照组od值
×
100％
[0086]
试验重复三次，计算平均值，spss软件计算ic50。
[0087]
对照品以同样方法计算ic50，结果如下：
[0088]
表7紫杉醇脂质体在个肿瘤细胞株上的ic50值
[0089][0090]
经spss算出的紫杉醇脂质体在8个细胞株上的ic50值见表6。8个细胞株的紫杉醇脂质体和taxol的均小于10μg/ml，均具有抑制肿瘤细胞增殖的效果，相比taxol紫杉醇脂质体对mcf-7、a549、bcap-37肿瘤株的抑制增值效果要好于紫杉醇注射液，这说明通过通过脂质体改良后，紫杉醇对某些肿瘤细胞的活性有了提升，可能的原因是脂质体的靶向作用增加了紫杉醇在某些肿瘤组织中的浓度，使得药效提高。

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