活性荧光染料通常用于标记蛋白质、核酸和其他生物分子，用于生命科学应用，包括荧光显微镜、流式细胞术、荧光原位杂交（FISH）、荧光共振能量转移（FRET）技术、受体结合分析和酶分析。

 一、异硫氰酸荧光素（FITC） 

羧基荧光素在使用前要被激活，与之相比异硫氰酸荧光素（FITC）更具活性，FITC主要是与巯基或者伯氨反应，如还原型半胱氨酸的侧链，尤其是多肽或蛋白中的氨基。

在很多应用中，荧光基团可以在化学合成的过程中引入，在选择性地去掉保护基团后，FITC可以与赖氨酸（Lysine）或鸟氨酸（Ornithine）侧链反应，或者与在合成过程中的多肽N端氨基反应。在N端标记时，在氨基和异硫氰酸盐反应形成的硫脲键之间会引入一个烷基间隔基，如氨基己酸（Ahx）。

二、四甲基罗丹明（TAMRA）

四甲基罗丹明（TAMRA），基于TAMRA的探针在细胞内分布均匀，在细胞质中扩散有效果。与FITC相比，TAMRA发色团具有多种优势，例如TAMRA比FITC表现出抗光漂白能力。 

FITC通常在494nm处激发，在520nm处发射荧光，而TAMRA的吸收峰值和发射峰值分别在546nm和580nm。更重要的是，TAMRA有一个额外的正电荷，可能会增加TAMRA与目标化合物之间的相互作用，从而促进探针与化合物的结合。与Cy3相似，TAMRA非常稳定且明亮，因此是一种荧光基团。而且，FITC和TAMRA标记可以组合使用，因为它们有不同的激发波长和发射波长，并且不会相互淬灭。 

通常FITC等染料可任意标记在多肽N端或C端。但我们推荐N端标记，其成功率更高、所需时间更短、更易操作。由于多肽都是从C端往N端合成，所以N端修饰将是固相合成的，不再需要额外的偶联步骤。相反，如果是C端标记，则需要附加步骤，而过程会更复杂。

三、单分子荧光染料——ATTO系列荧光染料

Atto染料可以用来取代普通的荧光染料。Atto染料具有更好的光稳定性和耐臭氧性，更长的信号寿命，更低的背景以提高灵敏度。它们是使用可见光和近红外发射波长的复合技术的理想选择。例如Atto 488就是荧光素和Alexa Fluor 488的优良替代品， Atto 550是罗丹明染料、Cy3和AlexaFluor 550的替代品，能产生具有更好的光稳定性和更亮的荧光的共轭物。