一般每个抗体可以标记3～5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：

1、用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。

2、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L，PH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml。

3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。

5、以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂素，所需的各种标记物均可购置。抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。将生物素与抗体共价结合是一种非常简便和直接的标记方法。通常，生物素对抗体并无负面影响且标记条件温和。