一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

生物素标记简易流程

一、生物素活化试剂的选择

1.待标记物的结构性质

2.标记物的应用目的

3.标记物与活化试剂比例计算

二、生物素标记

1.反应缓冲体系置换

2.反应时间优化

3.反应光照、振摇条件

三、标记物纯化

1.纯化方式选择

2.纯化效果考察

三、标记物测定

1.浓度测定

2.标记效率计算

四、标记物保存

1.保存浓度

2.保存条件

注意事项

1. 待标记物的蛋白浓度不能过低，如若浓度过低需经超滤浓缩等手段提高浓度至0.1mg/mL以上。

2. 一个蛋白质可能被多个生物素标记，标记时，生物素与待标记物应有合适的比例，确保标记后不影响待标记物的活性。推荐生物素：抗原蛋白比例为1~3：1，生物素：抗体比例为5~20：1或根据标记试剂盒说明书推荐比例。

3. 为减少空间位阻影响，基于检测灵敏度特异性等要求，可在生物素与被标记物之间加入交联臂结构。

4. 如果偶联基团为氨基，待标记物的系统不得含有游离的氨基（Tris,氨基酸）、载体蛋白（BSA）或者其他干扰物，若有干扰物需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净，若采用其他基团偶联试剂，待标记物系统亦不能有含对应的游离基团的物质。

5. 如果待标记物为分子量较小的物质，在纯化过程中注意超滤管、脱盐柱、透析袋的截留分子量。

6. 标记反应后的体积量至少在100μL以上，以达到纯化时的***小上样量。

7. 标记反应完成后（氨基偶联体系），可在体系中加入适量的含游离含氨基小分子物质，中和游离的生物素活化试剂，提高纯化效率，减少后续反应的假阳性和高背景。

8. 纯化后的标记蛋白可采用A280或BCA法测定蛋白含量。

9. 标记纯化后的蛋白可根据蛋白性质进行分装长期保存，减少冻融次数。